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FUS基因3`UTR突变对FUS-miRNA-141/200a调控循环的作用研究

日期:2017-04-05

课题研究思路

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一、NGS测序(临床样本或实验样本)——发现研究对象

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通过对420例临床样本进行高通量分析,发现2例病人中FUS基因3`UTR区域存在位点突变G48A。

二、背景调查——确认研究意义

1.   FUS基因3`UTR突变位点G48A位于miRNA-141和miRNA-200a的结合位点。上述两个miRNA属于同一个与人类健康和疾病相关的miRNA家族,研究表明其在肿瘤发展过程中会被下调,是上皮间质化(与正常细胞癌变或癌细胞恶变有关)的关键调控因子。

2.   临床数据分析

     通过多个临床已有数据库比对该基因在关注疾病中的表达或修饰变化(相比正常细胞),辅助验证上述NGS结果。

三、体外机制与功能验证——实施研究方案

1.   选择研究模型

      建立相关疾病体外细胞模型(细胞系或原代细胞)

2.   素酶报告基因试验检测突变对miRNA与靶基因3`UTR结合的影响

     构建携带野生型或突变型靶基因3`UTR的双荧光素酶报告基因质粒,与miRNA共转细胞,检测不同组荧光值变化。

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3.   构建靶基因野生型及突变型质粒

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4.   转染模型细胞研究上述突变对细胞功能的影响

      ●  细胞增殖(CCK8法)

      ●  细胞凋亡(Annexin Ⅴ-PI法)

      ●  细胞周期(PI染色FACS分析法)

      ●  细胞迁移(划痕实验/transwell法)

      ●  细胞侵袭(transwell法)

5.   调控机制研究

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●   FUS正调控miRNA141/200a生成(质粒转染/Real-Time PCR检测);

●   miRNA141/200a抑制FUS和Zeb1表达(质粒转染/WB检测蛋白表达);

●   Zeb1抑制miRNA141/200a基因转录;

●   FUS基因发生G48A突变后可以解除miRNA141/200a对FUS基因翻译的抑制,促进FUS蛋白表达,进而促进miRNA141/200a生成(质粒转染/WB检测蛋白表达/ Real-Time PCR检测miRNA表达);

●   miRNA141/200a生成增加对Zeb1抑制作用加强,进而也限制了Zeb1对miRNA141/200a生成的抑制,形成miRNA141/200a生成的正调控循环(Real-Time PCR检测miRNA表达);

至此上述机制解释了FUS突变及其引起的miRNA141/200a表达异常在疾病过程中的作用机制。

四、参考文献

Dini Modigliani SMorlando MErrichelli LSabatelli MBozzoni I. An ALS-associated mutation in the FUS 3'-UTR disrupts a microRNA-FUS regulatory circuitry. Nat Commun. 2014 Jul 9;5:4335.


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