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CO-IP/MS分析

日期:2017-05-10

课题研究思路

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示例:研究热休克蛋白90(HSP90)与NOTCH1的相互作用

●   鉴定HSP90与NOTCH1胞内段ICN1存在相互结合(Co-IP

于293T中共转染ICN(Flag)及HSP90过表达质粒,转染48h后收获细胞提取总蛋白,采用Flag标签抗体进行IP实验,Western-Blot检测HSP90是否存在于ICN1蛋白复合体中。

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●   确定相互作用特征带是HSP90(LC-MS/MS)

将与Flag标签抗体结合的蛋白复合体进行洗脱后,SDS-PAGE胶进行分离,考马斯亮蓝染色后对90kD位置的条带进行分离,并用胰酶消化过夜,对得到的肽段复合物进行LC-MS/MS分析,如下图所示,鉴定得分最高者为HSP90B,多肽序列DLVVLLFETALLSSGFSLEDPQTHSNR。

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参考文献

Wang Z, Hu Y, et al. Stabilization of NOTCH1 by the HSP90 chaperon is essential for lymphoblastic leukemia progression. Clinical Cancer Research. 2017 Jan 31. pii: clincanres.2880.2016. doi: 10.1158/1078-0432.

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